Metoda gjenetike molekulare kërkimore

Për të shqyrtuar dhe për të identifikuar variante në strukturën e ADN-së e përdorur metoda molekulare gjenetike. Për çdo rajon të ADN-së, e cila eksploron këtë rajon të kromozom, geni ose allele, metodat e ndryshme. Themelor çdo metodë molekulare gjenetik perfshin disa ose manipulimin tjetër të ARN dhe të ADN. Të gjitha këto metoda janë karakterizuar nga një kompleksitet të madh, pa kushte laboratorike nuk mund të kryhet, dhe stafi duhet të jenë shumë të kualifikuar. Kjo punë kryhet në disa faza.

fazat

E parë, ARN ose ADN mostra që do të prodhohet. Këtu, një metodë molekulare gjenetike mund të aplikohet për të praktikisht çdo materiali: një rënie të gjakut, leukociteve, fibroblasts kulturën, Mukoza (scraped), edhe follicles flokët, - ADN-ja mund të merret nga çdo mostër. Ai është i përshtatshëm për të përdorur ndonjë metodat molekulare gjenetike dhe mundësitë e tyre të ndryshme dhe kanë ADN izoluar prej kohësh është ruajtur ngrirë. Faza e dytë është dedikuar akumulimin e fragmenteve të dëshiruar (përforcim) e ADN-së, si ajo ndihmon siguruar reaksion zinxhir polymerase in vitro (in vitro, pa përfshirjen e organizmit gjallë). Si rezultat, të përzgjedhura shumëfishon fragment ADN-së nga ky reaksion zinxhir, dhe shuma e rritjes së ADN fjalë për fjalë miliona herë.

Hapi i tretë në metoda të kërkimit gjenetik molekulare është supozuar kufizimin e grumbulluar ADN (këtë fragmentimit, vrull ose prerja). Kufizim kryer nga elektroforeza në një polyacrylamide ose agarozë xhel. Kjo metodë molekulare-gjenetike të studiuar fragment ADN-së lejon të gjithë për të marrë një pozicion të caktuar në xhel. Pas kësaj, xhel është trajtuar me ethidium bram, aftë të lidhet me ADN-së, me rrezatim ultravjollcë, atëherë është e mundur për të vëzhguar porcione luminescence. Molekulare metoda gjenetike diagnostike janë të ndryshme dhe të shumta, por dy hapa e parë janë të njëjta për të gjithë. Por në mënyrë që të identifikojnë fragmente ADN-së, xhel mund të jetë me ngjyrë, dhe shumë metoda të tjera ekzistuese.

lloj

Metodat më të drejtpërdrejtë dhe të përhapura për zbulimin mykobatereve mund të përfshijnë metodën e mësipërme molekulare të mësuarit ADN gjenetike. Thelbi i saj është se, në mënyrë që të identifikojnë materialin scan zinxhir të fragmenteve të veçanta të ADN-së patogjenëve. Molekulare Teknikat gjenetike diagnostike ende nuk e kanë një mënyrë më efikase për të njohur sëmundjeve të tilla si tuberkulozi. Duke përdorur reaksion zinxhir polimeraza (PCR), ju mund të jeni i sigurt se ADN-ja origjinale do të rrisë numrin e kopjeve në një milion herë, që është, nuk do të jetë përforcim, dhe kjo do të tregojë rezultatet. Niveli i ndjeshmërisë është shumë e lartë - më shumë se nëntëdhjetë e pesë për qind, që është përparësi kryesore e kësaj metode.

Pjesa tjetër e metodave molekulare-gjenetike të hulumtimit mbi efektivitetin e jepnin kopje të shumta të vërtetë dyfishuar, pasi në këtë rast mostra hartimi tregon një sekuencë të veçantë oligonukleotide rritur në njëqind e gjashtë herë. Edhe kultura diagnozën e tuberkulozit të sistemit të frymëmarrjes ulur në mënyrë të konsiderueshme ndjeshmërinë e saj. Kjo është arsyeja pse mjekësia moderne është e bazuar në metodat molekulare gjenetike të diagnozën e tuberkulozit. Një metodë e përshkruar është efektive sidomos kur kanë të bëjnë me patogjenë të ndryshueshmërisë së lartë antigjenike, të përcaktuar në këtë mënyrë tjetër është shumë më e vështirë - kërkon të veçanta mediat ushqyese dhe kultivimin kohë të gjatë. metodat biokimike dhe molekulare gjenetike prodhojnë efekt shumë të ndryshme mbi rezultatet.

diagnoza e tuberkulozit

Marshall PCR Diagnoza e tuberkulozit më së shpeshti duke përdorur ato sekuenca ADN-së që janë specifike për të gjitha katër lloje të sëmundjes. Për të arritur këtë qëllim shpesh përdorin abetaret që zbuluar sekuenca IS elementet (IS-986, IS-6110), pasi këto elemente karakterizojnë speciet migratore shumë Mycobacterium tuberculosis dhe gjithmonë i pranishëm kopje të shumta në gjenomit. Gjithashtu nxjerrja ADN mund të kryhet nga kultura e pastër dhe Klinike (pështymë e pacientëve) nga çdo metodë tjetër të përshtatshme. Për shembull, metodë Boom ku buffer lysis është përdorur në bazë të thiocyanate guanidine dhe silice si ADN mbartese. Numri i pacientëve që ndryshojnë bakteriologjike të varfër në rritje çdo vit, dhe për këtë arsye në praktikën klinike ka krijuar një nivel krejtësisht të ndryshme të organizimit: Metoda molekulare-gjenetik i studiuar ADN-në ka qenë duke luajtur një rol të madh në diagnozën.

Megjithatë, ne duhet të pranoj se kjo nuk është pa të meta. Metoda PCR është përdorimi i shpesh sjell një numër të madh të rezultateve të rreme-pozitive, dhe arsyeja nuk është vetëm gabime teknike, por edhe tiparet e vetë metodës. Përveç kësaj, duke përdorur këtë metodë e diagnostikimit të përcaktuar realizueshmërinë e mykobatereve, të cilat janë identifikuar, ajo është thjesht e pamundur. Por ky disavantazh nuk është më e rëndësishme. metodat molekulare gjenetike të diagnostifikimit PCR të sjellë rrezikun e ndotjes së ADN-së mykobakterial. kërkesat e certifikimit për këtë arsye që për laboratorët PCR projektuar ekskluzivisht e vështirë, ata kërkojnë tre lokaleve të veçanta. teknologji PCR është moderne dhe shumë komplekse, ajo kërkon përdorimin e pajisjeve të përshtatshme dhe të personelit të lartë të trajnuar.

bacterioscopy

Kur rezultatet Diagnoza e analizës duhet të krahasohet me të dhënat e tjera: ekzaminimit klinik, radiografi, diskreditimi mikroskopi, kulture dhe madje edhe si përgjigje ndaj një trajtim të veçantë janë shumë të rëndësishme. Në këtë seri, studimet PCR është vetëm një nga komponentët. Zbuluar patogjen në diagnozën e hershme mund të jetë e thjeshtë dhe e shpejtë metodat e - bakteriologjike.

Nuk është përdorur një mikroskop dritë (ngjyrosje Ziehl-Neelsen) dhe fluoreshente (fluorochromes ngjyrosje). Avantazhi është shpejtësia shpifjeve rezultatet. Por pengesë e saj është konsideruar me të drejtë kapaciteti i kufizuar për shkak të ndjeshmërisë së ulët. Megjithatë, kjo metodë është dhënë OBSH rekomandimin si më ekonomike dhe terren për të zbuluar pacientët tuberkulozi. Zbulimi i metodës mykobaktere bakteriologjike ka vlerë parashikim dhe vlerësuar sekretim sasiore bakteriale. Shumë më të sigurt për t'u marrë me atë molekulare metodat kërkimore gjenetike të tuberkulozit.

kulturat

Zbulimi më i mirë i mykobatereve njohin studimet kulturore. Mbjellje materiale patologjike ajo është bërë në të mesme vezë: Mordovsky, Finn II, LJ, dhe si. Standardet e rezistencës së mykobatereve ndaj barnave dhe dëshmi indirekte e efektivitetit të një numri të mykobatereve dhe kolonitë e tyre në vitro, nëse metoda e aplikuar e kulturës kërkimore. Për të rritur përqindjen e izolimit të mykobaktere inokulimin e materialit patologjike është mbajtur në mjedise të shumta.

Plotësimin e nevojave të shumta kulturore, patogjen përfshirë grant dhe lëngjeve. E përdorur në këtë sistem dhe të automatizuar lloji matëse rritjes VANTES. Kulturat duhet të mbahet në inkubacion për deri në shtatë deri në tetë javë. Në këtë kohë kulture me mungesën e rritjes mund të konsiderohet negative. Mënyra më efektive për të zbuluar Mycobacterium tuberculosis konsiderojnë mostrat biologjike: diagnostikuese material infektojnë derra gini, të cilat janë jashtëzakonisht të ndjeshëm ndaj TB.

disa shifra

fushë interesante e studimit, e cila u hap nga diagnostifikim PCR ishte për të studiuar M. tuberkulozit - infeksion i fshehur. Koncepti modern i infeksionit TB sugjeron se prej njëqind njerëzve të cilët ishin në kontakt me M. tuberculosis, nëntëdhjetë mund të jenë të infektuar, por vetëm dhjetë prej tyre janë sëmundje aktive është duke u zhvilluar. Të tjerë kanë imunitet TB, dhe për shkak se nëntëdhjetë për qind të rasteve infeksioni mbetet latent. Zbuluar një model ajo ka ndihmuar një metodë molekulare gjenetike.

Gjenetistët thonë se pesëdhjetë e pesë për qind e atyre që materiali të korrat e të cilëve patologjike ishin negative, dhe tetëdhjetë për qind e njerëzve të infektuar me M. tuberculosis, por rrjedh pa manifestimet radiografike të sëmundjes, përgjigjet PCR pozitive të marra. Kjo është një metodë gjenetike diagnostike ndihmoi për të identifikuar pacientët në rrezik nga studimet e PCR, me rezultatet e analizave të tyre (mikroskopi dhe kulturës) janë negative, dhe infeksion subclinical M. tuberculosis ishte i pranishëm.

hulumtimet moderne

Federata Ruse dhe Laboratorëve bakteriologjike përdorur një metodë të përshpejtuar të përqëndrimeve absolute: aktivitet nitrat reductase e mykobatereve testuar nga Griess reagent. qendrat anti-TB përdorur një metodë që lejon për të përcaktuar rezistencën drogës. Kjo mbjellëse në media të lëngshme, ku automatizuar radioaktiv dhe sistemit të kontabilitetit fluoreshente rritjen e mykobatereve. Një analizë e tillë është bërë shpejt - deri në dy javë.

Aktualisht, metodat e reja janë duke u zhvilluar: rezistenca e drogës e mykobatereve matet në nivel gjenotip. Studimi i mekanizmave molekulare e gjeneve të rezistencës dhe tregon praninë në mykobatereve. Këto gjene janë të lidhura me rezistencë ndaj barnave të caktuara. Për shembull, gjenet kasa, Inha, katG rezistent ndaj izoniacid, rpoB gjenit - rifampicin 16Sp gjeneve ARN dhe rpsL - streptomicine, emb1 - për ethambutol, Gyra - një Fluoroquinolone etj.

mutacionet

Diagnoza moderne është rritur në mënyrë të konsiderueshme metodën molekular-gjenetik të nivelit për të studiuar ADN-në dhe për të lejuar për të kryer studime në shkallë të gjerë i mutacioneve në të gjithë spektrin e tyre. Tani ne e dimë se mutacionet më të zakonshme në 516, 526 dhe 531 kodonet-së rpoB gjen dhe identifikohet rezistencën ndaj drogave të ndryshme. Ka një gamë të tërë të metodave për të shtypur e mykobatereve përdorur jo vetëm metoda tradicionale - biokimike, biologjike dhe kulturore, por gjithashtu e përdorur gjerësisht moderne teknikat molekulare gjenetike. Tashmë ka të mjaftueshme dhe të ofrojë metoda e saktë diagnoza për zbulimin e sëmundjeve monogenic. Ato janë të bazuara në studimet e ADN-së në fushën e saktë të një gjen të veçantë. Kjo është zakonisht një proces i ndërlikuar, konsumon kohë dhe të shtrenjta, por të dhënat që është dhënë nga analiza molekulare gjenetike, është shumë më i saktë dhe informative se të dhënat e të gjitha analizave të tjera.

Ajo ka qenë prej kohësh e njohur se ADN-ja nuk ndryshon për të gjithë jetën e organizmit që është në çdo qelizat odnakova bërthamë, dhe kjo e bën të mundur për të marrë analizën e absolutisht të gjitha qelizat e trupit, në çdo fazë të ontogeny. Gjen i dëmtuar mund të zbulohet para shfaqjes së simptomave të para të sëmundjes klinike shkallë të plotë, si dhe në njerëz të shëndetshëm heterozygot, por që ka një mutacion në gjenin. sëmundje gjenetike e trashëguar metodat diagnostike molekulare lejojnë për të zbuluar e saj (qasje të drejtpërdrejtë, ADN-diagnostifikimi), si dhe për të analizuar ndarjen e sëmundjes në familje me ADN-marker loci (polymorphisms gjenetike), të cilat janë të lidhura ngushtë me një gjen të dëmtuar (p.sh., qasja e tërthortë e ADN-diagnostifikimit). Direkt ose indirekt - çdo diagnostifikimi ADN është i bazuar në metoda të identifikimin e një pjesë të përcaktuar rreptësisht të ADN-së njeriut.

metodat direkte

Metodat direkte të diagnostikimit të ADN-së janë kur sëmundja e trashëguar fajtori gjen është i njohur, si e njohur, dhe llojet e mutacioneve të saj. Për shembull, një metoda të përshtatshme të drejtpërdrejtë në një numër të sëmundjeve. Kjo korea Huntington (extension CTG-përsërit), phenylketonuria (R408W), fibrozë cistike (delF508, mutacionet e mëdha) dhe të ngjashme. Avantazhi kryesor i metodës së drejtpërdrejtë është një saktësinë tërësisht në pronësi diagnostike, dhe nuk ka nevojë për të bërë një analizë të ADN-së pjesës tjetër të familjes. Në qoftë se një mutacion në gjenin përkatës është gjetur, ajo lejon pikërisht miratojë një diagnozë të trashëgimisë, vendosmëri gjenotip për pjesën tjetër të familjes ngarkuar.

Një tjetër avantazh i diagnozës drejtpërdrejtë është konsideruar për të identifikuar një zgarë heterozygot të mutacioneve të këqija nga të afërmit dhe prindërit të cilët kanë vdekur nga kjo sëmundje. Kjo është veçanërisht e vërtetë për sëmundje autosomal ikës. Disavantazhet e metodave të drejtpërdrejta janë gjithashtu në dispozicion. Për të aplikuar ato, ju duhet të dini saktësisht se lokalizimin e parregullt gjen, strukturën ekson-Intron e spektrit të saj dhe mutacionet e saj. Jo të gjitha sëmundjet monogenic sot kanë marrë një informacion të tillë. Metodat Informativeness direkte nuk mund të konsiderohet i plotë, për shkak se një dhe i njëjti gjen mund të ketë një numër të madh të mutacionit patologjike që shkakton zhvillimin e sëmundjeve të trashëguar.

metodat indirekte

Metodat indirekte në diagnostifikim të ADN-së janë përdorur në të gjitha, në raste të tjera, në qoftë se gjen e dëmtuar nuk është identifikuar, por vetëm kromozomet, ose nëse linja diagnoza nuk ka dhënë rezultatin (kjo ndodh, nëse gjen organizata kompleksi molekular ose një masë të madhe, në qoftë se ka një shumë mutacionet patologjike). Metodat indirekte kryer analiza ndarjes së shënuesve polimorfik në familjen alelike. Shënuesit gjenden në të njëjtin rajon kromozomale ose gjeometrik është i lidhur me sëmundjen dhe përfaqësojnë fshirje ose insertions, zëvendësime pikë, përsërit dhe polymorphism tyre është për shkak të sasisë të ndryshëm të qelizave në bllok.

Më i përshtatshëm për diagnoza konsiderohet microsatellite dhe minisatellite polymorphisms indirekte, të cilat janë të shpërndara gjerësisht në gjenomin e njeriut. vlera e tyre e shprehur në përmbajtje të lartë të informacionit, nëse dëmtimi distanca gjenetike midis shënues dhe gjenit nuk është shumë e madhe. Në rastin e fundit, saktësia vlerësimi përcaktohet në një masë të madhe frekuencën e rekombinimit mes shënues polimorfike dhe dëme. Metodat indirekte diagnostike të sigurojë hap i detyrueshëm paraprak të frekuencave allele e studimit analizuar popullsisë në mesin e pacientëve dhe transportuesit e mutacioneve, plus domosdoshmërinë e përcaktimit probabilitetin e rekombinimit të nonequilibrium dhe aderimin shënuesit dhe alleles mutant.

metoda të tjera

segmente të shkurtra të ARN ose ADN-së, si dhe gjen single visualized nën studim mikroskopik nuk mund të jetë, pra, për të identifikuar mutacione të nevojshme nga diagnoza gjenetike molekulare. Nuk është një "projektit të gjenomit njerëzor", si dhe përparimet e tjera në gjenetikë molekulare zgjeruar në masë të madhe mundësinë e diagnostikimit të sëmundjeve të trashëguara - të dy para dhe pas lindjes. Këto metoda mund të sigurojë zbulimin e hershëm dhe të bëjë një poli- parashikim dhe sëmundjeve monogenic, debutues i të cilit zhvillohet në moshën e rritur. Për fat të keq, për shkak të aftësive teknike të studimeve gjenetike molekulare janë nganjëherë përtej kufijve etike që janë të vendosur në lidhje me trashëgiminë, sidomos kur diagnoza është në adoleshencë dhe në fëmijëri.

Strukturore dhe numerike anomalitë kromozomale janë shkaqet më të shpeshta të sëmundjes dhe të kancerit, dhe shumë keqformime. devijime kromozomale duhet të identifikohen, e cila është e rëndësishme për këshillim familjar - për të vlerësuar parashikimin, së bashku me rrezikun riprodhues në shtatzënitë e ardhshme. Analiza kromozom është "standard ari" i diagnostikimit gjenetik, por ajo është e kufizuar. Vetëm metodat e analizës molekulare gjenetike mund të bëjë më shumë, sepse ka përdorur klonimit teknologji bazuar etiketat fluoreshente të afta për të ndjeshmërisë së tyre të lartë për të identifikuar ndryshimet delikate kromozomale që janë të pamundur për të zbuluar klasike studimet cytogenetic. Këto teknika janë gjithnjë e zgjeruar aftësitë tona diagnostikuese, kur shqyrtohet, fëmijët me pengesa në zhvillim, vonuar mendor, me shumë sëmundje të tjera të trashëguar.

Gjetjet

Është shumë e rëndësishme për njerëzimin ishin struktura gjen dhe funksioni i dijes, llojet e ndryshueshmërisë, aftësia për të zbuluar sëmundje të trashëgueshme që kanë ndodhur në lidhje me zhvillimin e gjenetikës molekulare. metodat e saj kanë për qëllim studimin e molekulës së ADN-së - dhe kur ajo është normale, dhe kur ajo është e dëmtuar. Përgatitja e sekuencave të acidit dezoksiribonukleik e nukleotideve (DNA) shtrihet në fazat nga marrja mostra për identifikimin fragmente individuale. Izolimi i DNA genomike nga qelizat, kufizimin (shqyen), amplifikimi (klonimin), elektroforeza e fragmenteve (ndarjen e ngarkuar e tyre elektrik dhe peshe molekulare nga agarozë xhel). Identifikimin e fragmenteve specifike ndodhen në sipërfaqen e një shirit diskrete.

Pastaj duke marrë në filtrat aktit veçanta, përmes të cilave kalon secili hibridizimi fragment me fragmente të klonuar ADN ose sonda sintetike radioaktive është një kontroll, e cila do të jenë të barabartë me secilin model test. Nëse ju të ndryshojë pozicionin apo gjatësinë krahasuar me sondë, në qoftë se një fragment të ri apo të zhdukur - e gjithë kjo sugjeron se gjen analizuar ka pësuar ristrukturimit në sekuencën e nukleotideve. Ka tetë teknikat bazike të studimit gjenetike molekulare: sekuenca (përcaktimi i sekuencës së ADN-së) polimerazës reagimit zinxhir (rritje në numrin e sekuencave) përgatitja e mbushësit njohur gjeneve, klonimin DNA, prodhimin e molekulave rekombinante rrjedh proteinat shkak të molekulave recombinant, duke krijuar kështu një grup i plotë (grumbullimi biblioteka) klonuar fragmente që janë marrë duke përdorur kufizim.