Ndriçim fluoreshent mikroskopi: parimet e metodës

Thithjen dhe ri-emisionit të lëngjeve të lehta të mëtejshme inorganike dhe organike është rezultat i fosforeshencë apo ndriçim fluoreshent. Dallimi në mes të fenomeneve është kohëzgjatja e intervalit midis thithjen dhe emetimin e fluksit të lehta. Kur ndriçim fluoreshent i këtyre proceseve të ndodhë pothuajse në të njëjtën kohë, ndërsa fosforeshencë - me një vonesë.

Informacioni historik

Në vitin 1852, shkencëtari britanik Stokes, i pari e përshkroi ndriçim fluoreshent. Ai paraqiti një mandat të ri si rezultat i eksperimenteve me fluorit, që lëshojnë dritë të kuqe nën dritën ultravjollcë. Stokes vuri në dukje një fenomen interesant. Ajo është gjetur se gjatësi vale e rrezatimit fluoreshente është gjithmonë më i madh se rrjedhën e dritës ngacmim.

Për të konfirmuar hipotezën në shekullin e 19 ka pasur shumë eksperimente. Ata treguan se një shumëllojshmëri të mostrave fluoreshent nën ndikimin e dritës ultravjollcë. Ndër materialet, ndër të tjera, qenë Kristal, resins, minerale, klorofil, droga papërpunuar, komponimet inorganike, vitamina, vajra. Përdorimi i drejtpërdrejtë i ngjyra për testet biologjike ka filluar vetëm në vitin 1930

Ndriçim fluoreshent mikroskopi: Përshkrimi

Disa nga materialet e përdorura në gjysmën e parë të studimeve të shekullit të 20-të ekspozuara specifikat lartë. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Në sajë të performancës, të cilat nuk mund të arrihet me anë të kundërta metoda, metoda e ndriçim fluoreshent mikroskopi është bërë një mjet thelbësor në hulumtime biomjekësore dhe biologjike. Po aq rezultate të rëndësishme janë marrë, dhe për materialet.

? Çfarë avantazhet e bën metodën e ndriçim fluoreshent mikroskopi? Përdorimi i materialeve të reja është bërë e mundur dhe përzgjedhja e qelizave shumë të veçantë komponentët submicroscopic. Ndriçim fluoreshent mikroskopi mund të zbulojë molekulat vetme. Një shumëllojshmëri e ngjyra të lejojë identifikimin e sendeve të shumta në të njëjtën kohë. Pavarësisht zgjidhjen e kufizuar hapësinor të afatit shpërbërje të pajisjeve, e cila, nga ana tjetër, varet nga pronat e veçanta të mostrës, identifikimi i molekulave nën këtë nivel është gjithashtu mjaft e mundshme. mostrat e ndryshme pas rrezatim ekspozitë autofluorescence. Ky fenomen është përdorur gjerësisht në gjeologji, botanikë, industrinë e gjysmëpërçues.

Features

Studioni indet shtazore ose patogjenët shpesh të ndërlikuara ose shumë të dobët ose shumë të forta autofluorescence jo specifike. Megjithatë, vlera në studime fiton futjen në komponentët materiale ngacmuar në një gjatësi vale të caktuar dhe emitting intensitetin e nevojshëm rrjedhës lehta. Fluorochromes veprojë si ngjyra e aftë për të pavarur bashkangjitur në strukturat (dukshme ose të padukshme). Kështu, ata kanë një selektivitetit të lartë për të synuar, dhe rendimentin kuantike.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Ndriçim fluoreshent mikroskopi ka qenë përdorur gjerësisht që prej ardhjes së ngjyra natyrore dhe sintetike. Ata zotëronte profile të caktuara intensitetin e emetimit dhe ngacmim dhe në shënjestër për objektiva të veçanta biologjike.

Identifikimi i molekulave individuale

Shpesh, në kushte ideale, ju mund të regjistroheni një shkëlqim të veçantë element. Për këtë, ndër të tjera, është e nevojshme për të siguruar një zhurmë mjaft të ulët të detektor dhe sfond optik. molekulë fluorescein të dështimit për shkak të photobleaching mund të lëshojnë deri në 300 mijë. fotone. Në 20% efikasitetin e mbledhjes së procesit dhe mund të regjistrohen ato në një sasi prej rreth 60 mijë.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Ndriçim fluoreshent mikroskopi bazuar në photodiodes ortek ose shumëzimit elektronike, lejohet hulumtuesit për të vëzhguar sjelljen e molekulave individuale përmes të dytë, dhe në disa raste edhe minuta.

kompleksitet

Një çështje kyçe në favor shtypjen e sfondit zhurmës optik. Për shkak të faktit se shumica e materialeve të përdorura në projektimin e filtrave dhe lente shfaqin disa autofluorescence, përpjekjet e shkencëtarëve në fazat e hershme ishin të orientuar në prodhimin e komponenteve që kanë një ndriçim fluoreshent të ulët. Megjithatë, eksperimentet e mëvonshme kanë çuar në përfundime të reja. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Në veçanti, ajo u gjet se fluoreshent mikroskopi, bazuar në reflektim të përgjithshëm të brendshëm, ajo lejon për të arritur një sfond të ulët dhe me intensitet të lartë ngacmim dritë.

mekanizëm

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Parimet e ndriçim fluoreshent mikroskopi, bazuar në reflektim të përgjithshëm të brendshëm është përdorimi i valë kalimtar apo jetëshkurtër. Kjo ndodh në kufirin midis mediave me të ndryshme indekseve thyes. Në këtë rast, rrezja drita kalon përmes prizmit. Ajo ka një parametër të lartë thyes indeksi.

Prizmi ngjitur me solucion ujor ose qelqi me parametrat e ulët. Nëse një rreze të dritës drejtuar atë në një kënd që është më kritike, rrezja është reflektuar plotësisht nga interface. Ky fenomen, nga ana tjetër, shkakton valët nonpropagating. Me fjalë të tjera, fusha e gjeneruar elektromagnetike e cila depërton në një medium me një indeks parametër më të ulët thyes në një distancë më pak se 200 nanometra.

Jetëshkurtër Vala Intensiteti i dritës do të jetë e mjaftueshme për të nxeh fluorophores. Megjithatë, për shkak të thellësisë së saj tejet të vogël, vëllimi i saj do të jetë shumë i vogël. Rezultati është një background të nivelit të ulët.

modifikim

Ndriçim fluoreshent mikroskopi është i bazuar në reflektim të përgjithshëm të brendshëm, mund të zbatohet me epi-ndriçim. Kjo kërkon lente me hapje lartë numerike (të paktën 1.4, por është e dëshirueshme që ajo arriti 1.45-1.6), dhe pjesërisht ndriçuar aparatit në terren. Kjo e fundit është arritur me një madhësi të vogël vend. Për uniformitetit të madhe duke përdorur një unazë të hollë, e cila është e bllokuar nga një pjesë të derdhet. Për kënd kritike, pas së cilës ka një reflektim i përgjithshëm, ne kemi nevojë për një nivel të lartë të thyerjes së mesme zhytjes në lente dhe qelqi mbuluar të mikroskop.